Dans notre association, quelques adhérants se sont lancés dans la culture in-vitro pour obtenir des hybrides à partir de croisements intergénériques qu'on ne trouve pas dans le commerce. Mais n'ayant pas les moyens d'équiper un laboratoire spécifique avec hotte stérile, ils ont pratiqué une méthode bien plus économique, même s'il y a parfois quelques contaminations. Vous pouvez donc tenter à votre tour en utilisant les quelques conseils qui suivent.
  1. Nécessité d'un milieu stérile
    II faut travailler dans un milieu où les bactéries ne prolifèrent pas. En effet, considérons le système clos schématisé suivant :

    Dans un tel système, les croissances respectives de la plante et des bactéries sont représentées ci-dessous :

    Ce système n'est pas viable, car au bout de 2 à 4 jours les bactéries vont étouffer le milieu et dévorer les nutriments. Il faut donc travailler en milieu stérile.
  2. Stérilisation du système clos
    Deux méthodes sont proposées pour stériliser le milieu de culture.
    • Utilisation d'une hotte

      C'est un dispositif coûteux. De plus, il faut déterminer quand le filtre est saturé pour le changer à temps.
    • Travail autour d'une flamme
      On utilise la circulation d'air autour d'une flamme de bougie ou d’un petit brûleur au gaz. La température de la flamme est d'environ 2000 °C.

      Dans la zone stérile, on obtient 98 % de réussite. Il reste cependant des zones d'air qui ne sont pas purifiées : au-dessus de la flamme et autour des mouvements de circulation d'air. On fera attention de ne pas manipuler dans ces zones.
  3. Le milieu de culture
    Composition du milieu de culture :
    • agar-gar. C'est une gélatine à base d'algues qui permet d'obtenir des milieux semi-solides ;
    • composants indispensables : azote (N), phosphore (P) et potassium (K), à raison de quelques milligrammes par litre ;
    • des micro-éléments : Cu, Co, Mg, Mn, etc. ;
    • des sucres, pour faciliter la photosynthèse. C'est un inconvénient pour les orchidées car avec les sucres, elles développent un système racinaire qu'il faudra reconstituer dans leur nouveau milieu (c'est spécifique aux orchidées) ;
    • des hormones de croissance : auxines et cytokinines

    II existe 3 types d'auxines :
    AIA et AIB auxines de synthèse
    AMA naturelle qui se décompose avec la température
    Dans un milieu normalement constitué, il y a environ 60 composants, certains en proportion importante, d'autres en infimes quantités.
    On utilise habituellement deux grandes familles de milieu :
    • KNUDSON (peu riche), pour les orchidées et les plantes carnivores ;
    • MS (très riche) pour les rosiers, Saint-Paulia, ficus, fraisiers, etc.

    On utilisera un milieu enrichi en auxine pour la croissance et un milieu enrichi en cytokinine pour la multiplication.
  4. Préparation des flacons de milieu stérile
    • Préparer la dose de milieu solide et la dose d'eau distillée ou déminéralisée (préalablement passée au bain marie pour stérilisation et pesée).
    • Bien mélanger, remplir rapidement les flacons, agiter régulièrement le mélange entre 2 transvasements dans les flacons.
    • Stériliser en autoclave ou en autocuiseur.


    Après 30 minutes, on arrête le feu, puis on laisse la pression revenir d'elle-même. On sort les flacons, on les agite puis on les couche. Attention : le coton du bouchon ne doit pas être mouillé ; cela formerait un pont biologique qui polluerait le flacon.
    La figure suivante détaille le bouchon :
  5. Préparation de l'expérience
    Choisir un emplacement sans courant d'air afin de respecter la zone stérile.
    Pour la respiration, se munir d'un masque qui permet de rejeter l'air expiré vers l'arrière. Ôtez bague, montre, etc.

    Attention : la zone au-dessus de la flamme n'est pas stérile.
    Précautions à prendre :
    • ne pas oublier de mettre une blouse en coton ;
    • penser à éloigner la pipette d'alcool de la flamme ;
    • pour éviter de perturber la circulation de l'air, manipuler le plus lentement possible ;
    • ne pas toucher avec les doigts les ouvertures des flacons.
    Dispositions des flacons sur la table de travail :
  6. Semer les graines
    • Choix du désinfectant
      • Eau de Javel: Effet très long.
      • Hypochlorite de calcium: Effet de courte durée car instable. Il reste sur la partie superficielle de la graine, ne tue pas la graine et se dégrade rapidement. Il n'y a donc pas besoin de rincer.
      Pour les orchidées et les plantes carnivores, on choisit l'hypochlorite de calcium.
      Pour les plantes aquatiques, on préfère l'eau de Javel.
    • Préparation du désinfectant
      Pour préparer la solution d'hypochlorite de calcium, mettre un peu d'eau dans un flacon, et verser de l’hypochlorite de façon à saturer la solution. Attendre 10 minutes, puis filtrer. On doit obtenir une solution jaune limpide. Diluer cette solution à 5 %.
    • Nettoyage des graines
      C'est la partie qui est un peu ingrate car les graines sont microscopiques comme on peut le voir sur la photo suivante :

      C'est pourquoi il faut prendre une petite éprouvette (plus elle est petite, moins il y a de risque d'infection). Y verser un peu de désinfectant, puis y placer les graines. Maintenir fermé à l'aide du pouce préalablement désinfecté. Agiter pendant 3 minutes. Maintenir le tube à l'envers pendant une minute, puis retirer le pouce : le liquide coule et les graines restent dans le tube.
    • Semis des graines
      Semer les graines du fond vers l'avant du flacon à l'aide d'une spatule. Effectuer l'opération en une fois pour limiter les risques de contamination.
  7. Repiquage des plantules
    Une fois les graines semées, les flacons seront exposés à une lumière assez intense mais en faisant attention que les flacons ne chauffent pas, dans un endroit sec. Il faudra aussi éviter les écart de température pour que la croissance soit la plus régulière possible. La germination sera assez rapide si la température n'est pas trop fraiche. Ici un flacon montrant la germination après 7 jours :

    Il va se développer un protocorme, sorte de cal de cellules indiférenciées photographiés ici après 90 jours:

    Les protocormes vont ensuite donner naissance à une plantule, mais elles sont tellement serrées et le milieu a été épuisé de ses substances nutritives, si bien qu'il faut alors procéder à un repiquage. Pour ce faire, on saisit la plantule à repiquer et on l'enfonce légèrement dans le milieu en une seule fois (moins de risque de contamination). On obtient alors un flacon où les plantules ont un peu plus de place pour se développer comme on le voit ici

    Elles vont alors reprendre leur croissance, et il faudra parfois encore un repiquage avant que les plantules atteignent une taille raisonnable pour les sortir définitivement et les transplanter dans un substrat. On voit ici un flacon bien plein avant de sortir les jeunes plants.

    Quand enfin vous les transplantez, vous vous sentez récompensés de votre patience, comme on le voit ici avec de jeune paphiopedilum tout juste sortis de flacon.

    Vous pourrez alors offrir des jeunes plants à vos amis ou faire des échanges avec d'autres amateurs.
Nadia
Extraits du FORUM
Bonjour.
j'ai un gros problème, j'ai un flacon de Psygmorchis pusilla dont le milieu moisi. Ca a pas attaqué les plantules, mais faut que je sorte tout ce petit monde vite fait. Sauf que quand j'ai acheté ce flacon, il n'y avait pas le petit sachet de fongicide (ni les pots, ni le substrat d'ailleurs, mais il n’y avait rien dans le sac !), et je ne sais pas trop quoi utiliser, puisque le sachet fourni avec les flacons de Marie était anonyme, et que les fongicides et moi ça fait 2 ! J'ai un anti-pourriture poudre, marque Capiscol, à utiliser pour la monoliose, le botrytis, la pourriture de collet, pourriture blanche, la sclérotiniose et le botrytis allii, produit soluble dans l'eau. Etiqueté fongicide, contenant 50% de procymidone, utilisé pour les légumes en général. Est-ce que ce produit pourrait faire l'affaire ? Bonne journée a vous. CYRIL
Bonjour tout le monde,
Pour ta question CYRIL, le fongicide n'a rien d'une obligation, c'est une précaution supplémentaire. Il faut alors utiliser de l'aliette, à 2 gr par litre d'eau. Personnellement je ne le fais jamais sauf contamination très lourde qui aurait déjà abîmé les plantules. Ta contamination peut évoluer très lentement ou très vite, cela dépend du champignon en question. Quel aspect a-t-il? S’il n'a pas encore atteint les plantes il n'aura absolument aucun effet sur elles. Le produit que tu décris devrait être efficace mais ne l'ayant jamais utilisé je me méfierais de son innocuité. J'ai parlé avec des producteurs de pays variés et tous utilisaient exclusivement l'aliette. Amitiés. MARIE
Bonjour,
Voilà, j'ai acheté de l'aliette express J, contre le Phytophtora, c'est bien le produit dont il est question ? Sinon la moisissure est grise, duveteuse, et noire dans le fond. Je ne vois rien de propagé sur les plantules, mais j'ai pas encore ouvert. CYRIL
Bonjour,
C'est bien de ce produit qu'il s'agit, et ce genre de moisissure est effectivement agressif pour les plantes, mais pas forcément très rapide de croissance (si cela peut te consoler, il y a par exemple des mousses blanches ou une poudre grise qui recouvrent et tuent absolument tout en deux ou trois jours). Bonne nuit quand même ! MARIE
Salut .
C'est bon, j'ai tout rempoté, et bonjour le travail ! Vachement déçu par ce flacon, apparemment ce n'était pas un flacon de plantules en dernier repiquage, mais un flacon avec encore des protocormes (j'ai trouvé plein de petites billes vertes) qui ont continué à proliférer. Tout ça bien collé avec la moisissure qui a durcie le milieu... je vous dis pas le carnage. Je dois avoir sorti une bonne soixantaine de plantules, mais plus de la moitié n'avait plus qu'une racine ou deux, et plein de morceaux des plantes qui se sont divisées :(J'ai finalement abandonné l'idée d'un repiquage en substrat pour m'orienter vers la sphaigne en espérant que ça refasse des racines.) Bon week-end à tous. CYRIL
Bonjour, (17 septembre)
Aussi bizarre que cela puisse paraître, tous mes bébés Psygmorchis pusilla sont encore bien vert, j'ai même l'impression qu'ils font des racines ! Si ça continue je vais me retrouver avec une quarantaine de ces petites bêtes bien vivantes...CYRIL
Bonjour
Pas surprise pour CYRIL, bien souvent les contaminations n'ont que peu d'influence sur les taux de survie en sortie de flacon. Ce serait super que tu aies tout plein de cette adorable plante! J'en ai d'ailleurs semé ce matin même, ainsi que 16 autres trucs! Je prépare la relève. MARIE
Bonjour
une question peut être un peu bête, mais les Psygmorchis doivent perdre leurs feuilles en hiver (Cyril=mes Psygmorchis sont encore verte)??? RITA
Bonjour.
Ca je n'en sais rien, j'en ai jamais eu adultes, quand je dis que mes Psygmorchis sont encore bien verts c'est parce que suite à leur sortie de flacon désastreuse je pensais retrouver des petits ballots de foin dans la barquette plutôt que des petites plantules bien vertes). En tout les cas si ils les perdent il va pas rester grand chose de mes bébés ! CYRIL